Main description:

Mit dem nun separat publizierten Methodenteil der Diagnostischen Hamatologie wurde gezielt den Bedurfnissen von Diagnoselaboratorien in Kliniken und Praxen entsprochen. Neben den aktualisierten hamatologischen, cytochemischen und immunologischen Techniken werden nun auch neueste molekularbiologische Diagnosemethoden ausfuhrlich beschrieben. Leicht nachvollziehbare Protokolle und eine logische Strukturierung mit Marginalien zur raschen Orientierung macht dieses Methodenbuch zu einer unentbehrlichen Arbeitsvorlage fur jedes Diagnoselabor.

Contents:

I Allgemeine Methoden bei hamolytischen Anamien.- 1 Osmotische Resistenz der Erythrozyten.- 1.1 Osmotische Resistenz aus frisch entnommenem Blut.- 1.1.1 Normalbereich.- 1.1.2 Bewertung und Besprechung.- 1.1.3 Hinweise und Fehlerquellen.- 1.2 Osmotische Resistenz nach 24 Stunden Inkubation.- 1.2.1 Normalbereich.- 1.2.2 Bewertung und Besprechung.- 2 Plasmahamoglobin.- 2.1 Bestimmung des Plasmahamoglobins mittels Spektralfotometer.- 2.1.1 Normalwerte: unter 1,0 mg/100 ml.- 2.1.2 Besprechung.- 2.1.3 Hinweise und Fehlerquellen.- 2.2 Weitere Methoden.- 2.2.1 Benzidinmethode.- 2.2.2 Bestimmung von freiem Hamoglobin in Heparinplasma und Serum..- 3 Heinz-Koerper-Test.- 3.1 Normalwerte.- 3.2 Besprechung.- 4 Screening-Tests bei paroxysmaler nachtlicher Hamoglobinurie.- 4.1 Sucrose-Hamolyse-Test.- 4.1.1 Besprechung.- 4.2 Saure-Serum-Test (Ham-Test).- 4.2.1 Besprechung.- Literatur.- II Erythrozytenenzymdefekte als Ursache angeborener hamolytischer Anamien.- 1 Einleitung.- 2 Blutprobengewinnung, Erythrozytenreinigung.- 3 Hamolysatherstellung.- Literatur.- III Defekte der Erythrozytenmembran als Ursache angeborener hamolytischer Anamien.- 1 Einleitung.- 2 Blutprobengewinnung, Erythrozytenreinigung.- 3 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.- 4 Spektrin- und Ankyrin-Quantifizierung mittels ELISA.- 5 Strukturuntersuchung des Ankyrins.- 6 Strukturuntersuchung des Spektrins.- 7 Intraerythrozytare Kalium- und Natrium-Konzentration.- Literatur.- IV Anamien aufgrund von Stoerungen der Hamoglobinsynthese und -Struktur.- 1 Einleitung.- 2 Hamoglobinelektrophorese.- 2.1 Zellulose-Azetat-Elektrophorese.- 2.2 Starkegelelektrophorese.- 2.3 Zitrat-Agar-Gelelektrophorese.- 3 Hamoglobinstabilitats-Tests.- 3.1 Methyl-Violett-Test.- 3.2 Brillant-Kresylblau-Test.- 3.3 Isopropanol-Test.- 3.4 Hitzestabilitats-Test.- 4 Saulenchromatographie zur Hamoglobinanalyse.- 5 Hamoglobin F.- 5.1 Alkalidenaturierung.- 5.2 Saure-Elution.- 6 Hamoglobin A2.- 6.1 Hamoglobin A2-Messung.- 7 Hamoglobin S.- 7.1 Hamoglobin S-Loeslichkeitstest.- 7.2 Sichelzelltest.- Literatur.- V Serologische Methoden fur die Diagnose medikamenteninduzierter und autoimmunhamolytischer Anamien.- 1 Einleitung.- 2 Direkter Antiglobulin-(Coombs)-Test (DAT).- 3 Methoden zur Charakterisierung von Antikoerpern in Serum und Eluaten.- 3.1 Enzymbehandelte Erythrozyten.- 3.2 Loesungen mit niedriger NaCl-Ionen-Konzentration (LISS).- 3.3 Herstellung von Eluaten aus Patientenerythrozyten.- 3.4 Screening-Untersuchungen fur Serumantikoerper.- 3.5 Spezifische Diagnosetests bei autoimmunhamolytischer Anamie.- 3.6 Medikamentoes induzierte immunhamolytische Anamien.- Literatur.- VI Untersuchungen bei monoklonalen Gammopathien und immunologischen Defektzustanden.- 1 Biologische Bedeutung von monoklonalen Immunglobulinen.- 2 Nachweis von M-Gradienten in Serum und Harn.- 2.1 Probenvorbereitung.- 2.2 Proteinelektrophorese.- 2.3 Immunelektrophorese.- 2.4 Immunfixation.- 2.5 Berechnung eines monoklonalen Anteils aus quantitativen Immunglobulinbestimmungen.- 2.6 Nachweis und Differenzierung von Kryoglobulinen.- 3 Monoklonale Gammopathie unbekannter Signifikanz (MGUS).- Literatur.- VII Zytogenetische Diagnostik.- 1 Einleitung.- 2 Moeglichkeiten und Perspektiven der Tumorzytogenetik.- 3 Probenmaterial.- 4 Zellkultivierung und Herstellung der Chromosomenpraparate.- 4.1 Direktpraparation der Chromosomen.- 4.2 Kurzzeitkultivierung verschiedener Gewebe und zytogenetische Preparation.- 4.3 Langzeitkultivierung.- 4.4 Chromosomenfarbungen.- 4.4.1 Giemsa-Bandenfarbung mit 2X SSC-Vorbehandlung (GAG).- 4.4.2 Fluoreszenz-Bandenfarbung mit Quinacrin-Mustard (QFQ).- 4.4.3 C-Bandenfarbung mit Barium-Hydroxyd-Vorbehandlungen (CBG).- 4.4.4 Silberfarbung der aktiven Nukleolus-Organisation-Regionen an akrozentrischen Chromosomen (= Ag-NOR-Farbung).- 5 Auswertung.- 6 Zytogenetische Terminologie.- 7 Chromosomenanomalien und ihre Bezeichnung.- 7.1 Numerische Chromosomenanomalien.- 7.2 Strukturelle Chromosomenanomalien.- Literatur.- VIII Interphasenzytogenetik mittels Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH).- 1 Einleitung.- 2 Methodik.- 3 Anwendungen von FISH und Ausblick.- Literatur.- IX Zytochemische Methoden.- 1 Einleitung.- 2 Substanznachweismethoden.- 2.1 Eisen (Berliner Blau-Reaktion).- 2.2 PAS (Periodic Acid-Schiff)-Reaktion.- 2.3 Metachromasie-Nachweis mit Toluidinblau.- 2.4 Sudan-Schwarz-B-Farbung.- 3 Enzymnachweismethoden.- 3.1 Peroxidase-Reaktion (POX).- 3.2 Hydrolasen.- 3.2.1 Alkalische Phosphatase.- 3.2.2 Saure Phosphatase-Reaktion (SPh).- 3.2.3 Esterasenachweis mit Naphtylacetat oder Naphtylbutyrat ("neutrale Esterase").- 3.2.4 Saure Esterase-Reaktion (SEst).- 3.2.5 Chloracetat-Esterase.- 3.2.6 Dipeptidylaminopeptidase IV (DAP IV)-Methode.- 3.3 TDT (Terminale Deoxynucleotidyltransferase) Immunfluoreszenztechnik.- 4 Anhang.- 4.1 Fixierung (geeignet fur: Esterase, saure Phosphatase, DAP IV).- 4.2 Natriumnitritloesung, 4%.- 4.3 Pararosanilinloesung, 4%.- X Immunzytologie und Knochenmarkimmunhistologie.- 1 Einleitung.- 2 Praparationsmethoden.- 2.1 Untersuchungsmaterial.- 2.1.1 Knochenmark.- 2.1.2 Zytopraparate.- 2.2 Farbungen.- 3 Diagnostik immunhistologischer Knochenmarkbiopsien.- 3.1 Zellularitat.- 3.2 Verteilung der hamatopoetischen Zellen im normalen Knochenmark..- 3.3 Infiltrationsmuster.- 3.4 Fibrose und Sklerose.- 3.5 Reaktionsmuster mit applizierten Antikoerpern.- 4 Anwendungsgebiete.- 4.1 Lymphome.- 4.2 Therapiemonitoring am Beispiel der Haarzelleukamie.- 4.3 Akute Leukamie.- 4.4 Seltene Indikationen.- 5 Ausblick.- Literatur.- XI Durchflusszytometrie.- 1 Einleitung.- 2 Aufbau des Durchflusszytometers.- 2.1 Probenzufuhrung.- 2.2 Messung der Lichtstreuung.- 2.3 Messung der Fluoreszenz.- 2.4 Signalverarbeitung und Messung.- 3 Praparationsmethoden.- 3.1 Peripheres Blut/Knochenmarkaspirat (PB/KMA).- 3.2 Untersuchung von Bronchiallavagen, Punktaten und Lymphknoten...- 3.3 Oberflachentest.- 3.3.1 Oberflachenfarbung mit direkt markierten Antikoerpern.- 3.3.2 Arbeit mit indirekten Antikoerpern.- 3.4 Fixierung und Einfrieren von Proben.- 3.5 Nukleare Antigene.- 3.5.1 Ki67.- 3.5.2 Terminale Deoxynucleotidyl Transferase (TdT).- 3.6 Intrazellulare Antigene am Beispiel der Myeloperoxidase (MPO).- 3.7 Messung des DNA Gehalts.- 3.7.1 Durchflusszytometrische Beurteilung der DNA.- 3.7.2 Preparation von Zellen zur DNA Bestimmung.- 3.7.3 DNA-Messung.- 3.8 Messung des Rhodamin Effluxes (MDR).- 3.9 Respiratory Burst/Phagozytenaktivitat.- 3.10 Andere Praparationsmethoden.- 4 Analyse.- 4.1 Charakterisierung des normalen Knochemarks.- 4.1.1 Erythroide Reihe.- 4.1.2 Lymphoide Zellen.- 4.1.3 Myelomonozytare Linie.- 4.2 Durchflusszytometrische Charakterisierung des peripheren Blutes.- 4.3 Pathologische Veranderungen.- 4.3.1 Leukamien.- 4.3.2 Lymphome.- 4.3.3 Myeloproliferative Erkrankungen.- 4.3.4 AIDS-Monitoring.- Literatur.- XII In situ-Hybridisierung.- 1 Einleitung.- 2 Arbeitsgrundlagen.- 3 Wahl der Probe.- 3.1 DNA- und RNA-Sonden.- 3.2 Radioaktive Nachweismoeglichkeiten fur DNA und RNA.- 3.3 Nicht-radioaktive Proben.- 3.4 Labeling der Proben.- 3.5 Determination der Probengroesse und der Reinigung der Proben.- 3.6 Einfluss der Probenlange auf die Hybridisierungseffizienz.- 4 Detektionssysteme fur nicht radioaktive Methoden.- 5 Preparation der Objekttrager.- 5.1 Anmerkungen.- 6 Zellgewinnung von Zytopraparaten und Schnitten.- 6.1 Zell- und Gewebsaufbereitung von Blut bzw. Knochenmark.- 6.2 Praparatherstellung.- 6.2.1 Zytopsin von Zellsuspensionen.- 7 Permeabilisierung der Zellen.- 8 Prahybridisierung (RNA-Nachweis).- 9 Denaturierung der Target DNA bei DNA/DNA in situ Hybridisierungen.- 10 Hybridisierung.- 10.1 Anmerkungen.- 11 Posthybridisierung.- 11.1 Waschen der Praparate.- 11.2 RNAse-Nachverdau.- 11.3 Dehydrieren.- 11.4 Befilmen.- 11.5 Exposition.- 11.6 Entwicklung.- 11.7 Gegenfarbung.- 11.8 Eindecken.- 12 Spezifitatskontrollen.- 13 Quantitative Analytik (semiquantitativ versus automatisiert).- Literatur.- XIII Molekularbiologie in der medizinischen Diagnostik.- 1 Einleitung.- 2 Allgemeine Grundlagen der Molekularbiologie.- 2.1 Chemischer Aufbau der Nukleinsauren.- 2.2 Basenpaarung und Komplementaritat.- 2.3 Spaltbarkeit der Nukleinsauren.- 2.4 Aufbau der Gene.- 3 Untersuchung von Nukleinsauren.- 3.1 Isolierung der Nukleinsauren.- 3.1.1 DNA Isolierung.- 3.1.2 RNA Isolierung.- 3.2 Ausbeutebestimmung und analytische UEberprufung der Nukleinsauren.- 3.2.1 Messung der optischen Dichte.- 3.2.2 Gelelektrophoresen.- 3.3 Blotverfahren.- 3.3.1 Dot oder Slot Blot.- 3.3.2 Southern Blot.- 3.3.3 Northern Blot.- 3.4 Hybridisierungsverfahren.- 3.4.1 Markierung von Gensonden.- 3.4.2 Durchfuhrung von Hybridisierungen.- 3.5 Polymerasekettenreaktion (PCR).- 3.5.1 Prinzip der PCR.- 3.5.2 Durchfuhrung einer PCR.- 3.5.3 PCR Amplifikation von RNA nach reverser Transkription (RT-PCR)..- 4 Diagnostische Anwendungsmoeglichkeiten.- 4.1 Anwendung des Southern Blots.- 4.1.1 Erkennung von Punktmutationen.- 4.1.2 Nachweis von DNA Polymorphismen.- 4.1.3 Untersuchung von Translokationen und Rearrangements.- 4.2 Anwendungsbeispiele der PCR.- 4.2.1 Identifikation von Mutationen.- 4.2.2 Detektion von Translokationen.- 4.2.3 Amplifikation hochvariabler Regionen in humanen Genen.- 4.2.4 Amplifikationen von DNA in intakten Zellen.- Literatur.- XIV Methoden zum Nachweis und Monitoring einer HIV-Infektion.- 1 Einleitung.- 2 Primare Untersuchungen zur Feststellung der Seropositivitat.- 2.1 Herstellung der Antigene.- 2.2 HIV ELISA.- 2.3 Bestatigungstestverfahren.- 2.3.1 HIV-Westernblot.- 2.3.2 Immunfluoreszenz.- 2.3.3 Radioimmunprazipitationsassay (RIPA).- 3 Immunologisches Monitoring bei HIV-Infektion.- 3.1 p24 Antigentest.- 3.2 Neopterin.- 4 Methoden zum direkten Virusnachweis.- 4.1 Viruskultur.- 4.2 Polymerase chain reaction (PCR).- Literatur.