Main description:

Elektrophoretische Trennmethoden sind seit vielen Jahren ein nicht mehr wegzudenkender Bestandteil der analytischen Verfahren in den Bereichen Analytische Chemie, Klinische Chemie, Lebensmittelchemie, Medizin, Biologie, Pharmakologie. Das Buch fullt die bestehende Lucke bei deutschsprachigen Anleitungen zur Praxis elektrophoretischer Techniken. Alle wichtigen Methoden sind praxisbezogen und ubersichtlich zusammengestellt. Eine Vielzahl von Arbeitsanleitungen, tabellarisch dargestellen Puffer- und Trennsystemen, Anweisungen zum Giessen der Gele und zur Anfarbung von Enzymen und Proteinen bilden den Schwerpunkt des Buches. Das Buch soll dem in der Methodik Unerfahrenen in Studium, Forschung und Labor die Einarbeitung erleichtern und dem routinierten Fachmann als Leitfaden dienen. Die ausgewogene Darstellung von Theorie und Arbeitsanleitungen gibt bei der Auswahl und Beurteilung der Methoden eine verlassliche Hilfestellung und leitet zu deren erfolgreicher Durchfuhrung an.

Contents:

Theorie der elektrischen Wanderang.- 1 Einleitung.- 2 Grundlagen.- 3 Einflusse auf die Wanderungsgeschwindigkeit.- 3.1 Eigenschaften des geladenen Teilchens.- 3.2 Eigenschaften des Mediums.- 3.2.1 Einfluss der Ionenstarke.- 3.2.2 Einfluss des pH-Wertes.- 3.2.3 Einfluss der Komplexbildnerkonzentration.- 3.2.4 Einfluss der Temperatur.- 3.2.5 Einfluss des elektrischen Feldes.- 3.2.6 Einfluss des Tragermaterials.- 3.2.6.1 Ionenwanderung im Trager.- 3.2.6.2 Elektroosmose.- 3.2.6.3 Sogstroemung.- 4 Prinzipien elektrophoretischer Trennmethoden.- 4.1 Zonenelektrophorese.- 4.2 Methode der wandernden Grenzflachen.- 4.3 Isotachophorese.- 4.4 Isoelektrische Fokussierung.- Literatur.- Praxis der eindimensionalen Gelelektrophorese.- 1 Allgemeines zur Arbeitstechnik.- 2 Elektrophoreseapparaturen.- 2.1 Gerate fur die horizontale Elektrophorese.- 2.2 Gerate fur die vertikale Elektrophorese.- 3 Die einzelnen Elektrophoreseverfahren.- 3.1 Die Cellogel- und Zelluloseacetat-Elektrophorese.- 3.1.1 Die Cellogel-Elektrophorese.- 3.1.1.1 Anwendungsbeispiele.- 3.1.1.1.1 Lipoprotein-Muster im Zuge von Hyperlipamien.- 3.1.1.1.2 LDH-Muster.- 3.1.2 Die Zelluloseacetat-Elektrophorese.- 3.1.2.1 Vorbereitung der Membranen und Einsatz in der Elektrophoreseapparatur.- 3.1.2.2 Anwendungsbeispiele.- 3.1.2.2.1 Adenylat Kinase.- 3.2 Die Agar- und Agarose-Elektrophorese.- 3.2.1 Eigenschaften von Agar und Agarose.- 3.2.2 Allgemeines zur Agarose-Elektrophorese.- 3.2.3 Herstellung von Agarose Flachgelen zur Trennung von DNA-Moiekulen nach Schaffner.- 3.2.4 Aufbau einer Flachgelelektrophorese-Apparatur zur Trennung von DNA-Molekulen.- 3.2.5 Probenauftrag.- 3.2.6 Anfarben auf DNA.- 3.2.7 Bestimmung der Molmasse von DNA-Bruchstucken.- 3.2.8 Elution der DNA aus Agarosegelen.- 3.2.9 Anwendungsbeispiel.- 3.3 Die Starkegel-Elektrophorese.- 3.3.1 Herstellung von Starkegelen.- 3.3.2 Apparative Ausrustung.- 3.3.3 Anwendungsbeispiele.- 3.4 Die Polyacrylamidgel-Elektrophorese.- 3.4.1 Allgemeines zur Technik.- 3.4.2 Homogene Gele.- 3.4.2.1 Bestimmung der Groesse von DNA-Bruchstucken < 1 Kilobasen.- 3.4.2.1.1 Abhangigkeit des Fraktionierbereiches von der Polyacrylamid Konzentration.- 3.4.2.1.2 Herstellung homogener Flachgele.- 3.4.2.1.3 Elektrophoresebedingungen.- 3.4.2.1.4 Elution von DNA aus Polyacrylamidgelen.- 3.4.2.1.5 Herstellung dunner Flachgele.- 3.4.2.2 Die Bestimmung verschiedener Isozym-Typen.- 3.4.2.2.1 Definition des Begriffs Isozym.- 3.4.2.2.2 Herstellen der Gel-und Elektrodenloesungen.- 3.4.2.2.3 Eichbeziehungen zur Ermittlung von ladungs- bzw. molmassenisomeren Isozymen.- 3.4.2.3 Molmassenbestimmung in homogenen SDS-Gelen.- 3.4.2.3.1 Allgemeines zur Technik.- 3.4.2.3.2 Die Verwendung homogener Gele.- 3.4.3 Gradientengel-Elektrophorese.- 3.4.3.1 Allgemeines zur Technik.- 3.4.3.2 Das Herstellen linearer Gradientengele.- 3.4.3.2.1 Die Herstellung von Glaskassetten.- 3.4.3.2.2 Das Giessen linearer Gelgradienten.- 3.4.3.3 Die Bestimmung der molekularen Groesse nativer Proteine.- 3.4.3.3.1 Die Bestimmung der maximalen Wanderungsstrecke von Proteinen.- 3.4.3.3.2 Das Trennverhalten ladungsisomerer Proteine.- 3.4.3.3.3 Das Trennverhalten molmassenisomerer Proteine.- 3.4.3.3.4 Die Ermittlung des Stokes-Radius nativer Proteine.- 3.4.3.3.5 Die Bestimmung der Molmasse nativer Proteine.- 3.4.3.3.6 Die Bestimmung der Molmasse SDS-denaturierter Proteine.- 3.4.4 Elution von Proteinen aus Polyacrylamidgelen.- 3.4.5 Affmitats-Elektrophorese.- 3.4.5.1 Anwendungsbeispiele.- Literatur.- Praxis der Papier-, Dunnschicht- hzw. Saulenelektrophorese und Anwendungsbeispiele aus dem Bereich der anorganischen Chemie.- 1 Allgemeine Gesichtspunkte zur Arbeitstechnik.- 1.1 Tragermaterialien.- 1.1.1 Papiere.- 1.1.2 Tragermaterialien fur die Dunnschichtelektrophorese.- 1.1.3 Tragermaterialien fur die Saulenelektrophorese.- 1.2 Grundelektrolyt.- 1.3 Auftragung der Probe.- 1.4 Auswertung der Pherogramme.- 1.4.1 Papier- bzw. Dunnschichtelektrophorese.- 1.4.1.1 Qualitative Auswertung.- 1.4.1.2 Quantitative Auswertung.- 1.4.1.2.1 Direktbestimmungsmethoden.- 1.4.1.2.2 Elutionsmethoden.- 1.4.2 Saulenelektrophorese.- 2 Apparaturen.- 2.1 Papier- bzw. Dunnschichtelektrophorese.- 2.2 Saulenelektrophorese.- 3 Anwendungsbeispiele aus dem Bereich der anorganischen Chemie.- 3.1 Polyanionen.- 3.1.1 Polysulfandisulfonate.- 3.1.2 35S und 75Se markierte Polyselenandisulfonate und Polysulfan-selenandisulfonate.- 3.1.3 Polysulfandiphosphonate und -phosphonsulfonate.- 3.1.4 Halogenohydroborate.- 3.2 Chemisch ahnliche Anionen.- 3.2.1 ClO3-, ClO4-, BrO3, IO3- und IO4.- 3.2.2 Carbonsaure- bzw. Sulfonsaureanionen.- 3.2.3 Anionen aus radioaktiven Abfalloesungen.- 3.3 Metallkomplexe.- 3.3.1 Gemischtligandkomplexe von Pt-Elementen.- 3.3.1.1 Chloro-aquo-rhodium (III)-Komplexe.- 3.3.1.2 Chloro-bromo-iridate (IV).- 3.3.2 Gemischtligandkomplexe des Cr(III).- 3.3.2.1 Cyanato-ethylendiamin-chrom(III).- 3.3.2.2 Thiocyanato-8-hydroxychinolino-chrom(III)-Komplexe..- 3.4 Rutheniumkomplexe in radioaktiven Abfalloesungen.- 3.4.1 Kationische Rutheniumnitrosylnitrato-Komplexe.- 3.4.2 Umwandlung der Rutheniumnitrosylnitrato-Komplexe.- 3.4.2.1 Gleichgewichtseinstellung einer frisch hergestellten salpetersauren Rutheniumnitrosylnitratokomplexloesung bei Zimmertemperatur.- 3.4.2.2 Umwandlung einzelner isolierter Komplexe in Abhangigkeit von der Lagerzeit und der Temperatur.- 3.4.2.3 Verhalten bei Gefriertrocknung.- 3.4.2.4 Verhalten beim Eindampfen und Calcinieren.- Literatur.- Praxis der ultradunnschicht-isoelektrischen Fokussierang mit Tragerampholyten und immobilisierten pH-Gradienten.- 1 Allgemeine Gesichtspunkte zur Arbeitstechnik.- 1.1 Apparaturen.- 1.1.1 Stromversorgung.- 1.1.2 Trennkammern.- 1.1.3 Kuhlung.- 1.2 Herstellung ultradunner Gele fur die IEF mit Tragerampholyten.- 1.3 Herstellung dunner Flachgele fur die IEF in immobilisierten pH-Gradienten.- 2 Isoelektrische Fokussierung.- 2.1 IEF mit Tragerampholyten.- 2.1.1 Eigenschaften der Tragerampholyte.- 2.1.2 Wahl des pH-Gradienten.- 2.1.3 Gel-Zusammensetzung.- 2.1.4 Probenvorbereitung und -applikation.- 2.1.5 Trennbedingungen.- 2.1.6 Titrationskurven.- 2.2 IEF mit immobilisierten pH-Gradienten.- 2.2.1 Eigenschaften der Immobiline.- 2.2.2 Wahl des pH-Gradienten.- 2.2.3 Gel-Zusammensetzung.- 2.2.4 Probenvorbereitung und -applikation.- 2.2.5 Trennbedingungen.- 2.3 Bestimmung der pl-Werte.- 2.3.1 Einflussfaktoren auf den pl-Wert.- 2.3.2 pI-Messung.- 2.4 Visualisierungsmethoden.- 2.4.1 Proteine.- 2.4.2 Glykoprotein- und Lipoproteinanfarbung.- 2.4.3 Peptidanfarbung.- 2.4.4 Enzymanfarbung.- 2.4.5 Print-Techniken.- 2.4.6 Immunofixation und Immunoprint.- 2.4.7 Autoradiographie.- 2.5 Aufbewahrung und Dokumentation.- 2.5.1 Trocknung der Gele.- 2.5.2 Densitometrie.- 2.5.3 Photographie.- 3 Weitere horizontale Ultradunnschicht-Elektrophorese-Verfahren.- 3.1 Polyacrylamidgel-Elektrophorese.- 3.2 Disk-Elektrophorese.- 3.3 Gradientengel-Elektrophorese.- 3.4 SDS-Elektrophorese.- 3.5 Zweidimensionale Elektrophorese.- 4 Versuche zur isoelektrischen Fokussierung.- 4.1 IEF mit Tragerampholyten.- 4.2 IEF im immobilisierten pH-Gradienten.- 4.2.1 IEF im ultraengen immobilisierten pH-Gradienten.- 4.2.2 IEF mit Immobiline-Fertiggelen (DryPlates).- 4.2.3 IEF im immobilisierten pH-Gradienten fur die Hochaufloesende 2D-Elektrophorese von Bohnensamenproteinen.- Literatur.- Praxis der zwei-dimensionalen Elektrophorese von Proteinen.- 1 Einleitung.- 2 Arbeitstechnik.- 2.1 Charakterisierung der zwei-dimensionalen Elektrophorese.- 2.2 Apparaturen.- 2.2.1 Gerat fur die isoelektrische Fokussierung.- 2.2.2 Gerate fur die Elektrophorese.- 2.2.3 Stromgerate.- 2.2.4 Gerate zur Geltrocknung.- 2.2.5 Gerate zur Auswertung.- 2.3 Gele und Loesungen.- 2.3.1 Gele und Loesungen fur die isoelektrische Fokussierung.- 2.3.2 Gele und Loesungen fur die Elektrophorese.- 2.3.3 Loesungen fur die Farbung.- 2.3.4 Loesungen fur die Fluorographie.- 3 Versuchsdurchfuhrung.- 3.1 Versuch 1: 2DE in kleinen Gelen (SG-Technik).- 3.1.1 Probenherstellung.- 3.1.2 Isoelektrische Fokussierung.- 3.1.3 Elektrophorese.- 3.1.4 Farbung.- 3.1.5 Auswertung der Proteinmuster.- 3.2 Versuch 2: 2DE in mittelgrossen Gelen (MG-Technik).- 3.2.1 Probenherstellung.- 3.2.2 Isoelektrische Fokussierung.- 3.2.3 Elektrophorese.- 3.2.4 Fluorographie.- 3.2.5 Auswertung der Proteinmuster.- Literatur.- Praxis der praparativen Free-Flow-Elektrophorese.- 1 Einleitung und geschichtliche Entwicklung.- 2 Trennapparatur.- 2.1 Einleitung.- 2.2 Beschreibung der Apparatur Elphor VaP 22.- 2.3 Das Detektionssystem.- 2.4 Stroemungsprofile.- 3 Trennmethoden.- 3.1 Zonenelektrophorese.- 3.1.1 Prinzip.- 3.1.2 Anwendung.- 3.1.3 Beispiel.- 3.2 Isotachophorese.- 3.2.1 Prinzip.- 3.2.2 Anwendung.- 3.2.3 Beispiele.- 3.3 Isoelektrische Fokussierung.- 3.3.1 Isoelektrische Fokussierung im linearen pH-Gradienten.- 3.3.1.1 Prinzip.- 3.3.1.2 Anwendung.- 3.3.1.3 Beispiel.- 3.3.2 Isoelektrische Fokussierung im stufenfoermigen pH-Gradienten.- 3.3.2.1 Prinzip.- 3.3.2.2 Anwendung.- 3.3.2.3 Beispiele.- 3.4 Feldsprungelektrophorese.- 3.4.1 Prinzip.- 3.4.2 Anwendung.- 3.4.3 Beispiele.- 4 Spezielle Trennapparaturen.- 4.1 Einleitung.- 4.2 Biostream-Apparatur.- 4.3 RIEF-Apparatur.- 5 Anhang.- 5.1 Tabellen.- 5.2 Anwendungen der Free-Flow-Elektrophorese.- Literatur.